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Revistas.javeriana.edu.co

Univ. Sci. 2014, Vol. 19 (1): 11-29 Freely available on line
Técnicas analíticas contemporáneas para la identificación
de residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol
Y. Verónica Talero-Pérez scar Julio Medina 1, Wilson Rozo-Núñez2
Contemporary analytical techniques to identify residues of sulfonamides,
quinolones and chloramphenicol
Abstract
The excessive use of drugs in the veterinary industry generates bioaccumulation in animal organs, tissues,
muscles and fat. Depending on the concentration, these residues can reach man via the food chain. Food safety comprehends the use of these drugs and their residues such as sulfonamides, chloramphenicol and quinolones, which have been found in different slaughter animals. Some countries have limited regulations to control this issue. The implementation of standards set by the European Union is essential to monitor and control this problem at a national level. In this review, we use analytical techniques to identify the residues produced by these drugs, focusing on recently developed technologies that are essential tools to control this problem. Liquid chromatography combined with mass spectrometry and its various interface systems is the most recommended technology to detect residues in various food matrices.
Keywords: Bioaccumulation; growth promoters; drugs; residue control; food safety; liquid chromatography;
mass spectrometry.
Edited by Alberto Acosta
1. Grupo de investigación en Química y Tecnología de Alimentos Los antibióticos son sustancias químicas producidas por diferentes especies de microorganismos que suprimen 2. Laboratorio de Síntesis Orgánica, Grupo de Investigación en Química-Física Molecular y Modelamiento Computacional (Quimol), el crecimiento de otros microorganismos y pueden Escuela de Ciencias Químicas, Facultad de Ciencias, Universidad eventualmente destruirlos (P.T.I.NS. 1990). El anuncio Pedagógica y Tecnológica de Colombia, (UPTC) Tunja- Boyacá- del primer antibiótico sulfamídico en 1935 inició la era Received: 9-04-2013 Accepted: 23-11-2013 Published on line:
moderna de la terapéutica antimicrobiana, caracterizada por una enorme disminución de la morbilidad y de la Citation: Talero-Pérez YV, Medina OJ, Rozo-Núñez W (2014)
mortalidad para muchas enfermedades infecciosas Técnicas analíticas contemporáneas para la identificación de residuos 2006). El impacto de este de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol. Universitas Scientiarum 19(1): 11-28 doi: 10.11144/Javeriana.SC19-1.taci tipo de sustancias sobre factores médicos, veterinarios, de sanidad pública y económica relacionados con los Funding: Dirección de Investigaciones de la Universidad Pedagógica
y Tecnológica de Colombia.
estados patológicos, no tiene paralelo en la historia Electronic supplementary material: N/A
de la terapéutica medicamentosa. Por consiguiente, los antibióticos constituyen uno de los agentes Universitas Scientiarum, Journal of the Faculty of Sciences, Pontificia Universidad Javeriana, is licensed under the Creative Commons 2.5 of Colombia: Attribution - Noncommercial - No Derivative Works.
Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol farmacológicos empleados de forma reiterativa, y La administración de antibióticos a animales de en algunos casos usados sin ningún control, como abasto destinados al consumo humano, facilita el suplemento alimenticio o para tratar enfermedades control de enfermedades infecciosas y permite una en animales y favorecer su crecimiento, siendo mejora de la producción al promover el crecimiento. Sin administrados en numerosas ocasiones de forma embargo, dependiendo del tiempo trascurrido entre la insensata y en dosis inadecuadas. En consecuencia, administración de un antibiótico y el sacrificio (tiempo el empleo indiscriminado de estas sustancias puede de espera) pueden quedar residuos de estas sustancias producir alteraciones como: reacciones alérgicas, en los mismos tejidos utilizados como alimento. Estos carcinogenicidad, mutagenicidad, teratogenicidad, residuos se han encontrado a través del tiempo en anemia aplástica, súper-infecciones y retrasos en la muestras de pienso, pelo, orina, músculos, hígado, identificación del germen causal. En efecto, el uso riñones, grasa, leche, miel y huevos, especialmente irresponsable de los medicamentos facilita la liberación en animales de granja y se han encontrado también de fragmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN) en productos pesque que ayudan a las bacterias a aumentar la resistencia a ellos y colonizar ambientes en los que normalmente 2010). Estos compuestos y no podrían sobrevivir. Esta problemática es uno de sus metabolitos son eliminados a través de las heces los factores que incide en la aparición de gérmenes u orina de los animales tratados, dispersándose en el antibiótico-resistentes, creando la necesidad cada vez mayor de nuevos fármac Por consiguiente, resulta necesario establecer límites máximos residuales (LMR) para aquellas et al. Por ello se hace necesaria sustancias farmacológicas activas que se utilizan en los la existencia de una regulación y vigilancia estricta en el medicamentos veterinarios. El LMR se define como manejo de residuos que pudieran contener estos genes aquella concentración aceptable de una sustancia en que hacen a las bacterias más resistentes.
los tejidos comestibles de un animal (músculos, hígado, Generalidades: Los antibióticos se incluyen
riñones, grasa, leche, miel y huevos) y que al ser ingerida dentro del amplio grupo de compuestos que por el ser humano no constituye ningún riesgo para su forman parte de la composición de un pienso salud; por ello se fijan LMR para cada especie animal y animal, que pueden actuar con dos fines claramente 2005, . Debido a que el riesgo para los consumidores de productos alimenticios de origen 1. Como terapéuticos y profilácticos, debido a animal proviene de los residuos de los medicamentos, que los piensos constituyen una de las vías de que comprenden tanto el compuesto original como administración más usadas para suministrar sus productos de degradación, para la Unión Europea los fármacos en el sector veterinario. Los la evaluación de la seguridad de los residuos se realiza antibióticos se incorporan a los piensos en de acuerdo con edel forma de premezclas medicamentosas (sólidas Consejo de Europa, siguiendo un proceso conocido o líquidas) a concentraciones relativamente como análisis de riesgos, que abarca tres fases que discurren de forma secuenc 2001). La 2. Como promotores de crecimiento, en países primera, conocida como evaluación del riesgo, es de donde no están taxativamente prohibidos, cuya carácter eminentemente científico, la cual se divide, a su incorporación favorece el control de la flora vez, en cuatro etapas interrelacionadas: identificación bacteriana del animal, que se traduce en un del peligro, caracterización del peligro, evaluación mayor aprovechamiento de los nutrientes y un de la exposición y caracterización del riesgo. Las dos aumento considerable de peso. En este caso, primeras corresponden al proceso de identificación se incorpora al pienso en forma de aditivo y en de los residuos potencialmente peligrosos presentes concentraciones sub-terapéutict al. en los alimentos y a la evaluación cualitativa y cuantitativa de sus efectos. Esta evaluación se basa en la determinación de un nivel sin efecto para cada Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Talero-Pérez et al. sustancia activa ("no-observed-effectlevel"; NOEL) respecto a estos LMRs no hay claridad con los riesgos y en el establecimiento de factores de seguridad para asociados por la ingesta diaria de un mismo residuo de el cálculo de la ingesta diaria aceptable (IDA), que antibiótico y la sumatoria de esté, en un determinado es la cantidad de residuos que puede ser consumida tiempo, para una población y dieta específica. En diariamente por el hombre durante toda su vida sin general, se conoce que puede acarrear a la larga, riesgo apreciable para la salud. Paralelamente, se lleva a efectos acumulativos o alteraciones subclínicas que se cabo la evaluación de la exposición mediante la que se traducen en toxicidades crónicas o subcrónicas según estima cuantitativamente la ingesta de los residuos en función de una dieta estándar que incluye la totalidad de los alimentos en los que pueda aparecer el residuo Además, de la UE y la FDA, a nivel internacional, de interés. La caracterización del riesgo consiste en la el Codex alimentarius también ha establecido los LMR. estimación del riesgo para el consumidor teniendo en El trabajo desarrollado por la comisión del Codex cuenta su probabilidad de materializarse, establecida alimentarius es reconocido en el mundo entero por su durante el proceso de evaluación de la exposición, invaluable aporte a la protección del consumidor y al y la gravedad del mismo, determinada en la fase de comercio internacional. En síntesis el Codex alimentarius caracterización del peligro. Como resultado de esta junto con la FAO/OMS se ocupan de la ejecución del ponderación se decide la conveniencia de establecer programa sobre normas alimentarias, dentro del cual se unos límites máximos de residuos (LMRs), que indican establecen los LMR en los alimentos de tal forma que se la concentración máxima de residuos que puede garanticen la protección de la salud de los consumidores. aceptarse en un alimento como resultado del uso de Dado que en Colombia aún no se han definido dichos un medicamento veterinario en animales destinados al límites, es de resaltar que ya existe un proyecto de resolución; por lo tanto, para este tipo de regulación se hace necesario tomar como referencia la información La segunda fase del análisis de riegos consiste en de la FDA y la Unión Europea que han definido los la gestión del riesgo, en virtud de la cual se adoptan LMRs para diferentes sustancias entre las cuales se medidas necesarias para la prevención y el control del encuentran las sulfonamidas, cloranfenicol y quinolonas, riesgo de los residuos, la fijación de LMRs para cada en diferentes matrices aliment).
sustancia farmacológicamente activa formulada como medicamento, la determinación del tiempo de espera Al respecto, el cloranfenicol es una sustancia que debe transcurrir entre la última administración del prohibida en la UE y no tiene LMR, pero si tiene medicamento y el sacrificio del animal o la obtención asignado un MRLP (minimun required performance de sus productos de forma que no contengan residuos limit; por sus siglas en inglés) que es el límite mínimo en cantidades superiores a los LMRs fijados, el de funcionamiento exigido, dispuesto en la decisión desarrollo y validación de métodos analíticos de los 2002/657/CE de la Comisión Europea, en donde residuos y, finalmente, la implementación de planes se describe el nivel de concentración al cual una de investigación y control de los residuos tanto en los sustancia no autorizada ha sido medida. Esta situación animales vivos como en sus productos. pone de manifiesto el reto que enfrenta Colombia en materia de inocuidad de alimentos y de residualidad El análisis de riesgos culmina en la fase de de medicamentos presentes en productos de consumo comunicación del riesgo, consistente en el intercambio masivo; dada la creciente liberalización del comercio de información sobre el riesgo de los residuos entre de productos agrícolas y alimentos, y en particular, con todos los agentes involucrados: administraciones, relación al Tratado de Libre Comercio con los Estados consumidores, industria, etc. La información puede Unidos de América y otros países. De esta manera, se aparecer recogida en informes de expertos, informes hace necesario disponer de protocolos de diagnóstico sobre el resultado de los planes de control de residuos, suficientes que permitan definir la problemática, con alertas alimentarias, disposiciones legales, y se vehicula el fin de sentar las bases para su vigilancia y control. a través de los medios de comunicación de masas, Para ello Colombia debe definir las sustancias que páginas web institucionales y redes especializadas en pueden ser usadas y los límites permitidos, y a futuro seguridad alimeet al. 2004). Con su eliminación completa para la producción animal. Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol Tabla 1. LMRs para diferentes sustancias sulfonamidas, cloranfenicol y quinolonas, en diferentes matrices alimentarias.
Niveles de tolerancia de antibióticos en comidas estipulados por la Unión Europea (EU) y la administración de drogas y alimentos de USA (FDA) Los escasos controles en este tema dejan de manifiesto Cada vez aparecen más estudios que describen la y abierta la posibilidad, de que el uso de sustancias detección de residuos de antibióticos e permitidas se encuentren fuera de los límites mínimos 2012) y sedimentos y estudian los efectos recomendados por el Codex aliment negativos que pueden ejercer a mediano y a largo plazo en los organismos y microorganismos que habitan en los ecosistemas. En algunos sedimentos Problemas en el Medio Ambiente: Algunos de
cercanos a explotaciones ganaderas se ha detectado los antibióticos administrados como promotores un aumento de cepas bacterianas resistentes a algunos del crecimiento se absorben poco en el tracto antibióticos. Aun, se siguen efectuando estudios para gastrointestinal de los animales, eliminándose a obtener más información acerca de su persistencia en través de las heces a elevadas concentraciones. Otros el medio ambiente, empleándose para tal fin la técnica antibióticos, por el contrario, se absorben a nivel de Cromatografía Líquida- Espectrometría de Masas intestinal, los cuales pueden ser eliminados por la orina Tandem (LC- et et dispersándose estas sustancias en el medio ambiente. al. 2006, 2007). Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Talero-Pérez et al. El uso de antibióticos como promotores del
la Unión Europea desde el 1 de enero de 2006 ha crecimiento animal: Los antibióticos son sustancias
establecido por Reglamento 1831/2003 una moratoria naturales o sintéticas con actividad farmacológica que para el uso de coccidiostáticos e histomonostáticos. se administran a los animales sanos a través de los Algunos antibióticos usados como promotores de piensos para acelerar la ganancia de peso y mejorar los crecimiento, tales como la avoparcina, la espiramicina, índices de transformación de los alimentos; aunque la bacitracina, la tilosina y la virginamicina, por ser afectan la microbiota normal. Actualmente se admite todas sospechosas de contribuir a la aparición de el uso de la monensina, salinomicina, flavofosfolipol nuevas cepas bacterianas resistentes a los antibióticos y avilamicina. Como inforet al. (2000) y et al. 2009); Por tal (2001) los promotores de crecimiento pueden motivo, el Codex alimentarius, la Comunidad Europea ser de tres tipos: (CE) y los gobiernos de Japón, Estados Unidos, entre otros, establecen límites máximos residuales 1. Antibióticos y quimioterapéuticos de actuación (LMRs) para regular cada sustancia no autorizada en sobre la microflora bacteriana del tubo digestivo, en un alimento en particular et al. 2009). Así concentraciones entre 30 y 100 mg/L, administrados mismo el Codex lo hace para asegurar la inocuidad sistemáticamente durante largos periodos.
para el consumo humano. Debido a estos efectos, se 2. Sustancias ionóforas que actúan sobre el rumen.
han propuesto varias alternativas a los antibióticos 3. Anabolizantes, generalmente sustancias de tipo utilizados como promotores de crecimiento. Estas hormonal, los cuales actúan como promotores alternativas consisten en utilizar sustancias de origen de crecimiento mediante una acción sobre el natural que presenten un efecto antibacteriano directo o indirecto como algunas enzimas, ácidos orgánicos, prebióticos, oligosacáridos, aceites, extractos vegetales, En la práctica agrícola moderna, los medicamentos vitaminas y micro-minerales.
veterinarios se están utilizando a gran escala y administrados como aditivos para piensos o el agua de Técnicas instrumentales utilizadas en la
bebida con el fin de inhibir el brote de enfermedades. identificación y cuantificación de residuos de
Además, las drogas veterinarias se dan en los casos de fármacos y antibióticos en alimentos de origen
enfermedad, para la deshidratación o para prevenir animal: Dada la necesidad de detectar y cuantificar los
las pérdidas durante el transporte. La promoción de residuos de antibióticos en alimentos de origen animal, agentes del crecimiento (por ejemplo, hormonas y desde la segunda mitad del siglo veinte son múltiples ciertos medicamentos veterinarios, principalmente los métodos analíticos desarrollados ó modificados de antibióticos) se aplican para estimular el crecimiento los ya existentes, siendo las técnicas cromatográficas de los animalet al. 2011). Por esta situación, las de más amplio alcance. (Figura 1).
Fig. 1. Evolución de las técnicas analíticas empleadas. QqQ: triple cuadrupolo, QTI: cuadrupolo con trampa de
iones, TOF: Tiempo de vuelo, QqTOF: cuadrupolo tiempo de vuelo, TLC: cromatografía en capa fina.
Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol Dentro de las técnicas existentes hoy en HPLC: Es una técnica separativa y su poder para
día se destacan el empleo de biosensores por discriminar una sustancia de otra va a depender del inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el cual detector. La elección del sistema de detección es muy permite manejar gran número de muestras debido a importante para la selectividad y sensibilidad del analito su bajo costo y facilidad operativa, siendo un ensayo a identificar; el detector de arreglo de diodos (DAD) rápido para la evaluación cualitativa y presuntiva de o detector ultravioleta (UV) han sido utilizados para los antibióticos en los alimentos de origen animal. la detección de antibióticos en carne, riñón y leche, Aunque su especificidad y sensibilidad depende del según Organización Mundial de la antibiótico a analizar, siempre se tendrá que utilizar Salud (OMS) det al. 2003).
métodos de confirmación los cuales permiten obtener información adicional para la cuantificación El empleo de LC con detector UV o DAD e identificación inequívoca del analito ( (Detector con Arreglo de Diodos), se ha empleado en cisión de la Comisión 2002/657/CE) la determinación de bacitracina de zinc ( et al. 2001), y para el análisis de residuos de sulfonamidas presentes en distintas matrices de animales; este método se caracteriza por su mayor sencillez y rápidez Como técnicas de confirmación se utilizan, generalmente, cromatografía de gases (GC) y 2007), mientras que GC-MS (Cromatografía cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). de gases con detector de masas) es aplicada para efectos Cuando se emplea la cromatografía de gases acoplada a confirmativos. Sin embargo, es importante tener en la espectrometría de masas (GC/MS), las sulfonamidas cuenta que la robustez del procedimiento es un factor y tetraciclinas requieren una derivatización previa para al momento de elegir el método analítico adecuado para aumentar su volatilidad y originar fragmentos de masa fines reglamentarios. La HPLC, resulta la más indicada molecular adecuados para el análisis de trazas.
para el análisis de antibióticos en pescados, dado que se Sin embargo, los métodos cromatográficos no caracterizan por ser termolábiles y polares están exentos de inconvenientes. Por ello, es pertinente evaluar los factores que limitan sus costos de t al. 2007). La cromatografía líquida de ultra-alta implementación (equipamiento, capacitación técnica, presión (UHPLC) acoplado con espectrometría de infraestructura de laboratorios, costo por análisis, masas cuadrupolar y tiempo de vuelo (UHPLC-MS- tiempo entre la recolección y el resultado); destacando QTOF), se ha empleado para la detección de residuos la dificultad de analizar grandes volúmenes de muestras de múltiples antibiótic 2009, en tiempos reducidos, indispensable para llevar a tt al. 2013) en diversas cabo programas de vigilancia y control efectivos, o el matrices biológicas como el riñón, músculo e hígado requerimiento de tratamientos de muestra laboriosos tt al. 2012).
y equipos costosos, por lo que es necesario desarrollar nuevos métodos simples y.
Recientemente se desarrolló un método basado en la cromatografía líquida de interacción hidrofílica La Cromatografía Líquida (LC): La cromatografía es
alta presión electrospray acoplado a Tándem (HILIC- el nombre que se le da a un grupo de técnicas utilizadas UPLC-ESI-MS/MS; et al. 2010). Este en la determinación de la identidad, cuantificación y permitió analizar 24 residuos de medicamentos en separación de sustancias en una mezcla, las cuales se músculo de pollo, el cual se caracterizó por mostrar basan en el mismo principio: todos los sistemas de una mejoría en separación de los analitos en estudio, cromatografía abarcan una fase estacionaria y una fase mejorando la forma de las señales y la sensibilidad móvil. La cromatografía Líquida comprende todas para la detección de los mismos.
las técnicas cromatográficas que usan una fase móvil líquida, entre las cuales están la cromatografía de Cromatografía Líquida Espectrometría de Masas
papel, la cromatografía en capa fina, la cromatografía (LC-MS): Las agencias de salud pública en muchos
en columna y la cromatografía líquida de alta eficiencia países se basan en la detección por espectrometría de masas para la identificación inequívoca de Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Talero-Pérez et al. los residuos de agentes antimicrobianos en los popularización de los analizadores de masas de alta productos alimenticios de origen animal destinados al resolución (HRMS) como el TOF (por sus siglas en consumo humano. La introducción de esta técnica es inglés de Time Of Flight), está dada por la exactitud, relativamente de fácil acceso y robusta. Al respecto el la velocidad y la selectividad para generar el espectro sistema LC-MS ha dado un fuerte impulso al desarrollo de nuevos y mejores métodos para determinar y confirmar la presencia de residuos de medicamentos en matrices alimentarias.
Cromatografía Líquida acoplado a espectrometría
Tres aspectos han incidido en el desarrollo de las de masas (LC-MS): Es una técnica robusta, sensible
interfaces de LC-MS: y selectiva, y se ha convertido en una técnica muy 1. La volatilización del efluente de la columna, difundida para el análisis cuantitativo y cualitativo la eliminación de los constituyentes de la fase t al. 2009). También se emplea en la móvil, la volatilización del analito y posterior detección de residuos de medicamentos veterinarios en huevos, leche, pescados y carne et al. 1995, 2010). Dado que la 2. La ionización directa del efluente, como por técnica de GC-MS requiere de pretratamiento de ejemplo, la ionización por bombardeo del flujo del la muestra y derivatización del analito, la LC-MS es analito en la interface.
una alternativa que requiere menos complejidad para 3. La volatilización del efluente de la columna la determinación de sulfonamidas; la mayoría de los a presión atmosférica o a una presión reducida, métodos LC-MS publicados para el análisis de este desolvatación de las gotas, seguida de la ionización tipo de fármacos se basan en la HPLC/APSI-MS química en fase gaseosa o iónica por ejemplo, evaporación, termospray, electronebulización (ESI) y la interface caliente del nebulizador APCI. En la práctica, la interface elegida impone limitaciones tanto para la metodología aplicable LC (velocidad del flujo y la composición del disolvente) y la técnica Algunos métodos se basan en la derivatizacion post de ionización aplicable en la MS.
et al. 2004) o prec En la práctica, la interface elegida determina las limitaciones tanto en la metodología cromatográfica 1996) con fluosesencia (FLD). a elegir (caudal y composición del disolvente), como también en la técnica de ionización para la Los primeros trabajos que utilizaron espectrometría de masas (MS).
métodos LC-MS para analizar promotores de crecimiento emplearon fuentes de ionización Entre los diferentes analizadores de masas por termopulverización (TSP). Posteriormente y habitualmente empleados para el análisis elegido, el siguiendo la evolución de las técnicas de ionización en sistema triple cuadrupolo (QqQ) es el más utilizado espectrometría de masas acoplada a la cromatografía para la medición y cuantificación de los residuos de líquida, la TSP fue desplazada por las técnicas de medicamentos vete et al. 2009, ionización a presión atmosférica (API), que incluyen 2009). La trampa de iones la electronebulización o electrospray (ESI) y la convencional (IT) proporciona espectros de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI); óptima resolución que permiten realizar experimentos sin embargo, ESI sigue siendo la fuente de iones de caracterización estructural para confirmar más utilizada para el análisis de antibióticos en los la estructura molecular de los metabolitos. El alimentos, debido a la alta polaridad que presentan cuadrupolo lineal IT (QqLIT) es un sistema funcional estas sustanc et 2004, que combina QqQ y LIT-MS completamente en el mismo instrumento. Una tendencia reciente hacia la Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol Acoplamiento TANDEM (MSn): La espectrometría
Contribución de la Cromatografía de gases,
de masas, ya sea en modo simple MS o en tándem GC-MS y electroforesis capilar: Técnicas que
(MS/MS), es la técnica de detección más extendida acopladas identifican residuos compuestos polares y no volátile 2003) y residuos de origen animal.
2004, et al. et al. et al. et al. t al. 2008, Cromatografía de gases y GC-MS: GC-MS es una
técnica analítica separativa ampliamente utilizada para la 2012). La espectrometría de masas, sin duda alguna, separación de compuestos volátiles e isotopos atómicos, la técnica analítica instrumental más completa que dependiendo de sus puntos de ebullición. Esta técnica existe actualmente. Entre las cualidades que justifican ha sido la más empleada por exactitud, sensibilidad esta afirmación, podemos citar, su capacidad de y reproducibilidad, dado que permite la separación identificación, análisis de muestras complejas, alta e identificación de mezclas complejas. Luego de su sensibilidad, caracterización estructural e isotópica separación las moléculas del analito son bombardeadas de moléculas, por lo cual es considerada, universal, por electrones rompiendo los enlaces (en ocasiones no específica y relativamente rápida. El acoplamiento necesariamente), generando fragmentos moleculares cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC- cargados, los cuales son propios de la naturaleza de cada MS/MS) es especialmente adecuado para el análisis compuesto. Dado que este proceso requiere volatilizar en química ambiental debido a su gran sensibilidad y el analito, la técnica GC-MS no es muy apropiada para selectividad; también se ha utilizado en el análisis de analizar residuos de medicamentos, debido a que en su residuos de medicamentos veterinarios. gran mayoría poseen altos pesos moleculares, pero si fueran sustancias volátiles GC-MS seria la técnica más Además, se conoce que la sensibilidad y la adecuada. Otro factor que incide en la aplicación de especificidad son dos características importantes para el análisis de trazas y la detección de un analito. Al este método es la inestabilidad térmica de los analitos respecto, el acoplamiento MS/MS presenta grandes y la falta de volatilidad de muchos antibióticos que ventajas prácticas respecto a MS simple, debido a que hacen que la técnica GC-MS sea de difícil aplicación. mejora la calidad y la cantidad de la información en Además, la cromatografía de gases (GC) es una técnica términos de selectividad y elucidación estructural. muy sensible y específica, pero la aplicación rutinaria Este tipo de acoplamiento junto con cromatografía de de este método no es fácil para un gran número de gases o la cromatografía líquida, ofrece una poderosa muestras, debido a la purificación y múltiples pasos combinación, siendo ampliamente considerada requeridos para la derivatizac et al. 2003, como la técnica más definitiva para aspectos de tipo t al. 2009). Por esta razón (LC-MS/MS) es normativo. Por ello, entre sus aplicaciones actuales la técnica complementaria de GC-MS más adecuada más reconocidas se puede mencionar los ensayos de debido a su amplia aplicabilidad para la determinación fármaco-cinético, detección de interferencia de fondo, de compuestos polares y no volátile separación de componentes de mezclas con diferentes pesos moleculares, la fragmentación controlada y Electroforesis Capilar (CE): La electroforesis capilar
reproducible, y el monitoreo de reacciones, entre otras.
(CE) permite la extracción selectiva y la concentración Entre las aplicaciones más representativas podemos de los residuos veterinarios en materiales de relativa mencionar un estudio que permitió la determinación complejidad, siendo a menudo una operación de un de bacitracina de zinc en matrices aliment solo paso, con un rendimiento comparativamente alto. et al. 2001). De forma análoga se logró determinar CE se ha convertido en una herramienta muy útil para la presencia de avoparcina, espiramicina, tilosina el análisis farmacéutico debido a su alta velocidad de y virginamicina, prohibidos como promotores de resolución, y al reducido volumen de muestra que es crecimient, por cromatografía líquida requerido. Sin embargo, el uso de CE en bioanálisis en fase reversa-espectrometría de masas (LC-ESI-MS/ de medicamentos está restringido debido a la baja MS). La viginamicina también ha sido cuantificada por sensibilidad de la técnic. Una forma LC-MS (t al. 2003).
de mitigar el problema de determinar analitos que Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Talero-Pérez et al. estén a muy bajas concentraciones, es la aplicación en alimentos de origen animal, mediante electroforesis procedimientos de preconcentración, los cuales capilar acoplada a espectrometría de masas cuadrupolar han demostrado ser útiles posibilitando determinar con ionización por electrospray (t al. concentraciones inferiores al LMR admisible en los t al. 2007). Recientemente se ha utilizado productos animales. Los electroforegramas muestran la electroforesis capilar (CE) con detector UV para la una buena resolución y no hay interferencia con otras determinación de residuos de tetraciclina ( señales, lo que indica una adecuada especificidad y sensibilidad de este método para muestras de músculo, hígado, riñón y piel con g et al. 2003).
Las técnicas de interface más empleadas (Tabla 2)
para la determinación de residuos de medicamentos Al respecto, estudios han demostrado la presencia en diferentes matrices alimentarias; se resumen a de residuos de quinolonas y otros tipos de antibióticos Tabla 2. Opiniones publicadas recientemente. TLC: Cromatografía en capa fina, FLD: Detector de fluorescencia,
ITD: detector de trampa de iones, ESI: Ionización por electro-spray, CE: Electroforesis capilar, ECD: Detector
de captura de electrones, QqQ: triple cuadrupolo, Q-TOF: cuadrupolo tiempo de vuelo, HILIC: Cromatografía
líquida-interacción hidrofilica, DAD: Detector de diodos, MSn: Tándem.
Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol En términos generales, la evolución que han sulfamerazina, sulfametazina, sulfamonometoxina, tenido estas técnicas analíticas a lo largo de los años, sulfaclorpiridazina, sulfaquinoxalina, sulfadimetoxina, ha sido el resultado del desarrollo de múltiples áreas entre otras); Por ejemplo, los residuos de las de investigación como el análisis medioambiental sulfonamidas (sulfadimetoxina, sulfametazina, , el desarrollo de nuevos sulfametoxazol) pueden causar rash cutáneo, así como fármacos, el análisis de residuos de medicamentos afecciones endocrinas, particularmente en tiroides veterinarios, la caracterización de productos naturales y pituit. Luego se encuentran y de bio-moléculas tales como los péptidos, proteínas, las quinolonas (ácido oxolínico, cinoxacina), oligosacáridos, lípidos y oligonucleót fluoroquinolonas (enrofloxacina, sarafloxacina, ciprofloxacina, danofloxacina; t 2010), donde según la resoluc N° 1966 de 1984 se reglamenta el uso de productos o sustancias Antibióticos comúnmente detectados en antimicrobianas como promotores de crecimiento o
alimentos de origen animal: Se presenta una visión
mejorados de la eficiencia alimenticia. No obstante, general de algunos de los antibióticos más empleados se siguen hallando residuos en diferentes matrices en la práctica veterinaria y que se han detectado en alimentarias, siendo un asunto que afecta la salud alimentos; como es el caso del cloranfenicol, un pública y considerando necesario su estudio. Además, antibiótico de amplio espectro que solo debe ser se describen las técnicas analíticas más empleadas para considerado como un medicamento de reserva, su identificación y cuantificación, las cuales se presenta cuando no existan otras alternativas terapéuticas; a continuación: debido a los efectos de resistencia microbiana en la actualidad, junto con la indudable toxicidad que Sulfonamidas: Son N-derivados de la 4-amino-
presentan, además, de sus efectos secundarios como bencenosulfonamidas (sulfanilamida), comprenden fetotoxicidad, anemia aplástica, la supresión de la un gran grupo de compuestos antibacterianos medula ósea, un mayor riesgo de leucemia infantil y sintéticos, en el cual el átomo de nitrógeno amídico el síndrome del bebé gris. En efecto, este antibiótico, está parcialmente sustituido por un fragmento que durante mucho tiempo se ha presentado por ser heteroarilo (heterociclo, sulfadiazina) responsable de fácil acceso y económico, sigue siendo ampliamente de las propiedades farmacocinéticas que presentan utilizado pero ha quedado limitado para su uso. Así (Figura 2).
mismo, en este apartado también se hablará de un grupo de medicamentos veterinarios con efecto Algunos estudios indicaron que presentan anabólico, y que están dentro de las sustancias propiedades carcinogénicas después de observar pertenecientes al grupo B según la directiva 96/23/EC, el desarrollo de adenomas en la glándula tiroides en donde se encuentran las sustancias antibacterianas: en animales de experimentact al. Sulfonamidas (sulfadiazina, sulfatiazola, sulfapiridina, 1989). Revalidando este hecho, algunos residuos de sulfonamidas en los alimentos son de interés debido Fig. 2. Estructura Química de las sulfonamidas.
Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Talero-Pérez et al. a su carácter cancerígeno potencial y la posibilidad De este modo, las sulfonamidas impiden la de desarrollo de resistencia a los antibióticos en incorporación de PABA a la molécula de ácido fólico, dificultando su biosíntesis, etapa esencial para el crecimiento y la multiplicación bacteriana. Así pues, . Aunque las sulfonamidas se han los microorganismos sensibles a las sulfonamidas son utilizado en medicina humana contra una amplia aquellos que deben sintetizar su propio ácido fólico, o variedad de microbios, el uso actual es principalmente bien son impermeables al ácido fólico de los líquidos en el tratamiento de infecciones del tracto urinario.
También se conoce, que este tipo de fármacos son La TLC (Cromatografía en capa fina) se ha ampliamente utilizados en piensos de animales de utilizado como método de barrido derivatizando las granja y en cultivos de peces como medicamentos para sulfonamidas con fluorescamina para su detección. En fines profilácticos y terapéuticos. Además, se sabe que el transcurso de los años, la TLC ha sido mejorada, el grupo de las sulfonamidas actúa como sustancias pero sigue siendo una técnica poco precisa y de difícil promotoras del crecimiento. La Unión Europea (UE) cuantificación, por lo que se reserva como método de así como los organismos reguladores de Estados barrido. Además, esta metodología requiere laboriosas Unidos han establecido un límite máximo de residual etapas de tratamiento de muestra y purificación con el de sulfonamidas en 100 mg/kg; el nivel de regulación fin de evitar interferencias, incrementando el tiempo en la leche e).
de análisis y su costo.
Las sulfonamidas son antimicrobianos de amplio Sin duda alguna, la técnica más utilizada como espectro, sus propiedades antibacterianas se deben a método de cuantificación y confirmación para el que son capaces de inhibir la producción del ácido análisis de residuos de sulfonamidas y tetraciclinas, es fólico, necesario para la síntesis de ADN, impidiendo la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con la reproducción de las células bacterianas. La analogía distintos tipos de detección como UV y espectrometría entre la estructura de las sulfonamidas y del ácido para-aminobenzoico (PABA), necesario para la síntesis del ácido fólico bacteriano, hace que actúen como Quinolonas: Las quinolonas son compuestos
antagonistas competitivos, debido a que se unen heterocíclicos aromáticos que se caracterizan por que a la enzima tetrahidropteroicosintetasa necesaria en su estructura química está presente el anillo de la para la condensación del ácido fólico. Este ácido piridona, con un grupo carboxilo libre o protegido en la es convertido en tetrahidrofolato, que actúa como posición 3. El nitrógeno generalmente tiene unido a un coenzima en la transferencia de grupos metilo a las radical que puede ser una cadena lineal o un carbociclo bases púricas y pirimidínicas para la síntesis del ADN (R1), siendo este último sustituyente responsable en y et al. 1999).
gran medida de la actividad biológica (Figura 3).
Estructura base de las quinolonas
Estructura de la enrofloxacina
Fig. 3. Estructura Quimica de las quinolonas.
Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol Las quinolonas muestran una excelente actividad Cloranfenicol (CAP): El cloranfenicol es una molécula
contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Estos orgánica, cuya estructura corresponde a un derivado compuestos actúan sobre los microorganismos sensibles del nitrobenceno, sustituido en la posición 4. En esta inhibiendo la replicación del ácido desoxirribonucleico ramificación se encuentra presente un enlace tipo amida, (ADN) bacteriano, careciendo de efecto sobre la síntesis como también la presencia de dos grupos hidroxilo y dos nuclear de las células eucariotas (.
átomos de cloro. La presencia del anillo del nitrobenceno Las quinolonas son a menudo usadas en la es relevante debido a que este se transforma en aminas industria ganadera y en los criaderos de peces, cuando aromáticas, las cuales pueden ser carcinogénic se presentan cuadros infecciosos de tipo pulmonar, 2003); la existencia del grupo hidroxilo facilita urinario y digestivo, dado que actúan como inhibidores la formación de esteres que mejoran la hidrosolubilidad bacterianos. Actualmente es una sustancia controlada, del antibiótico (Figura 4).
con el objetivo de minimizar el riesgo para la salud Es un antibiótico de amplio espectro humana asociados con el consumo de sus residuos.
frecuentemente utilizado en la producción de animales por sus excelentes propiedades antibacterianas y Uno de los métodos más utilizados para cuantificar farmacocinéticas. Este antibiótico es muy efectivo quinolonas residuales es la Cromatografía Líquida de pero puede inducir anemia aplástica y producir otros Alta Eficiencia (HPLC) con detector de fluorescencia desórdenes sanguíneos a niveles muy reducidos et al. 2012). Algunos estudios han mostrado (trazas). Estos efectos adversos han determinado que los mejores resultados de extracción del analito la prohibición del cloranfenicol para el tratamiento se obtuvieron con acetonitrilo y a diferentes pH. Al de animales usados en la producción de alimentos respecto, se sabe que, por ejemplo, la enrofloxacina 2003, 2009). El ), una quinolona de uso veterinario, se encontró cloranfenicol se fija a la subunidad 50S del ribosoma presente en muestras de pescado, músculo de pollo, tras penetrar por difusión facilitada en el citoplasma de músculo de ganado porcino, bovino y o la bacteria, al ser una molécula pequeña y no polar. La et al. 2005).
unión al ribosoma se realiza de tal forma que impide la fijación del aminoacil ARNt, al inhibir de forma También en años recientes se ha empleado un sistema reversible la peptidil transferasa, por lo que se detiene analítico instrumental más moderno como la LC-MS/ la síntesis proteica. El cloranfenicol podría inhibir MS (Cromatografía Líquida- Espectrometría de Masas también la síntesis proteica en células eucariotas, lo Tandem) para identificar y cuantificar quinolonas en que justificaría en gran medida algunos aspectos de su pollo e hígado de bovino, en músculo de bagre y cerdo, toxicidad. La consecuencia para la bacteria sensible es en leche y tejidos de la inhibición de su multiplicación, por lo que el efecto es bacteriostático en bacterias susceptibles ( Fig. 4. Estructura Química del cloranfenicol.
Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Talero-Pérez et al. El cloranfenicol, en estado libre tiene muy baja ha ocasionado la aparición de gérmenes antibiótico- solubilidad en agua, pero es altamente soluble en lípidos. resistentes, provocando múltiples alteraciones Las sales de palmitato presentan características similares patológicas, toxicidades crónicas o subcrónicas según de solubilidad a diferencia de las de succinato que son los casos. El impacto que ha tenido este tipo de prácticas altamente solubles en agua. Al tratarse de una sustancia en aspectos médicos, veterinarios, económicos y en la prohibida, la UE ha establecido un MRPL para el de muchos países, no tiene paralelo en la historia de la terapéutica medica. Esta problemática de salud pública internacional ha permitido el desarrollo y Respecto a los métodos analíticos de cuantificación, validación de métodos analíticos para la determinación la cromatografía de gases y la líquida de alta eficiencia y cuantificación de residuos de cloranfenicol, (HPLC), iniciaron su desarrollo y aplicación en la sulfonamidas y quinolonas.
década de los 70s. Los procedimientos de preparación de la muestra en estos métodos involucran extracción Al respecto la cromatografía de gases y cromatografía con solventes y procesos de partición con mezcla líquida en combinación con los diversos analizadores de de solventes. En años más recientes, la técnica más masas, son las técnicas instrumentales más empleadas empleada para cuantificar cloranfenicol es HPLC actualmente para la determinación y cuantificación acoplada a espectrometría de 2002, de cloranfenicol, las sulfonamidas y las quinolonas. Las tecnologías más recientes son las de trampa de iones lineal (LIt), trampa orbital (Orbitrap) y la nueva La diferenciación y aplicación de los métodos generación de instrumentos híbridos, tales como, el descritos para identificar y cuantificar la presencia de cuadrupolo de tiempo de vuelo (QqTOF), trampa de residuos de antibióticos en alimentos, está basada en cuadripolo lineal (Qq-Lits) o trampas lineal de orbitales la capacidad de detección y practicidad del método (LTQ-Orbitrap), que están ganando una amplia para medir niveles trazas en el tejido objetivo. Para aceptación en varias áreas de aplicación. Todos estos propósitos de selección, la electroforesis capilar, instrumentos ofrecen ventajas como análisis rápidos, cromatografía electrocinética micelar y ensayos de mediciones exactas de masa (QqTOF, LTQ-Orbitrap) y resonancia de plasmones superficiales se han utilizado altas sensibilidades (LIt y la nueva generación de QqQ). para el análisis de residuos de múltiples fenicoles El rango de aplicación de la espectrometría de masas (cloranfenicol es un tipo de fenicol) en diferentes multidimensional es hoy en día extremadamente amplio, matrices. Cromatografía líquida acoplada a detector en términos de los compuestos de interés.
UV así como GC-ECD (cromatografía de gases con detector de captura de electrones) también se han Con el desarrollo de nuevas técnicas e interfaces utilizado para la determinación de la CAP en los bovinos, que involucran sistemas de ionización a presión porcinos, músculo de aves de corral, pescado, leche y atmosférica, ionización por electrospray y de ionización tejidos de c et al. 2009). Sin embargo, química a presión atmosférica, la introducción de las los métodos que utilizan cromatografía acoplada a tecnologías cuadrupolares y sistemas tándem, han espectrometría de masas (LC-MS/MS), sigue siendo el permitido la determinación de compuestos con masa método recomendado para confirmar inequívocamente molecular elevada y sustancias no volátiles, sin recurrir la presencia de cloranfenicol en diferentes matrices a la derivatización, entre los que se encuentran los fármacos de uso veterinario y agentes que promueven el crecimiento, los cuales han sido posible detectar, identificar y cuantificar satisfactoriamente.
Es necesario que las entidades responsables de vigilar la salud pública en el país determinen frecuentemente El uso indiscriminado de fármacos como el cloranfenicol, los niveles de sustancias permitidas como promotores las sulfonamidas y las quinolonas en la industria de crecimiento y ajusten las recomendaciones y los veterinaria como suplemento alimenticio, para tratar niveles máximos.
enfermedades en animales y favorecer el crecimiento, Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28 Técnicas para identificar residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol cisión de la comisión del 12 de agosto de 2002 por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Los autores agradecen a la Dirección de Investigaciones Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia por analíticos y la interpretación de los resultados notificada la financiación otorgada para realizar ésta investigación y su con el número C(2002) 3044 (2002/657/CE), Diario oficial de las comunidades Europeas, L221:8 (2009) Desarrollo, Optimización y Validación Conflicto de intereses
de métodos analíticos para la determinación de Los autores expresan que no existe conflicto de intereses.
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Técnicas analíticas contemporâneas para a identificação de
residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol
resíduos de sulfonamidas, quinolonas e cloranfenicol
Resumen. El uso excesivo de fármacos en la industria
Resumo. O uso excessivo de drogas na indústria veterinária
veterinaria genera bioacumulación en órganos, tejidos, gera bio-acumulação em órgãos, tecidos, músculos e gordura músculos y grasa animal. Dependiendo de la concentración, animal. Dependendo da concentração, estes resíduos chegam estos residuos llegan al hombre vía cadena alimentaria. La ao homem através da cadeia alimentar. Os regulamentos para normatividad para dicha problemática en algunos países, este problema em alguns países não é suficiente, por isso é no es suficiente, por eso es fundamental establecer normas essencial estabelecer normas estipuladas pela União Europeia, estipuladas por la unión europea, sentando bases para su que determina as bases para o monitoramento e controle a vigilancia y control a nivel nacional. La seguridad alimentaria nível nacional. A segurança alimentar está relacionada com o está relacionada con el uso de fármacos y sus residuos, ejemplo uso de fármacos e seus resíduos, por exemplo, sulfonamidas, de ellos, son las sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol, que quinolonas e cloranfenicol os quais foram encontrados em se han encontrado en diferentes animales de abasto.
diferentes animais para abate. En esta revisión, se incluyen técnicas analíticas empleadas Nesta revisão, incluem-se técnicas analíticas utilizadas para la identificación de los residuos generados por fármacos, para a identificação dos resíduos gerados pelos fármacos, enfatizando en aquellas tecnologías de reciente desarrollo y enfatizando as tecnologias recentemente desenvolvidas as que son herramientas fundamentales para el control de esta quais são ferramentas essenciais para controlar este problema. problemática. La cromatografía líquida combinada con la Cromatografia líquida combinada com a espectrometria de espectrometría de masas y sus diferentes sistemas de interfaces, massa e seus vários sistemas de interfaces são as tecnologias son las tecnologías más recomendadas para la detección de este mais recomendadas para a deteção deste tipo de resíduos em tipo de residuos en diferentes matrices alimentarias.
diversas matrizes alimentares.
Palabras clave: Bioacumulación; promotores de crecimiento;
Palavras-chave: Bio-acumulação; pomotores de crescimento;
fármacos, control de residuos; seguridad alimentaria; fármacos; controle de residuos; segurança alimentar; cromatografía líquida; espectrometría de masas.
cromatografia líquida; espectrometria de massa.
Universitas Scientiarum Vol. 19 (1): 11-28

Source: http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/article/viewFile/6618/5859