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elles permettent d'injecter la quantité de préparation strictement nécessaire.

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Rapport de Stage De Mathieu GINESTE

Maître de Stage :

Michel Pucéat
Equipe Cellules ES et Différenciation cardiaque
CRBM CNRS FRE2593
1919 route de mende
34293 MONTPELLIER, France
Sujet du Stage :

Oct-4 module la spécification puis la différenciation des
cellules souches embryonnaires vers un phénotype cardiaque.
Oct-4 module la spécification puis la différenciation des cellules souches
embryonnaires vers un phénotype cardiaque.

Résumé

Oct-4 est un des facteurs de transcription les plus précocement exprimés au cours du développement
embryonnaire et est reconnu pour son rôle dans la maintenance de la pluripotence des cellules ES. Nous
démontrons dans cette étude le rôle d'Oct-4 dans la différenciation cellulaire, et plus précisément dans la
différenciation cellulaire cardiaque. Nous montrons d'abord, in vitro
et in vivo, que l'expression d'Oct-4 est
modulée par Nodal, un facteur précoce inducteur du mésoderme. Nous montrons ensuite que la
surexpression d'Oct-4 résulte en une spécification puis une différenciation cardiaque des cellules ES.
Nous montrons enfin que l'inhibition du pic d'expression transitoire d'Oct-4 se traduit par des anomalies
de développement. Ces résultats suggèrent ainsi qu'Oct-4 régule l'expression de ses gènes cibles de
manière dose-dépendante.

Introduction
Une étape indispensable dans l'approche intégrative pour comprendre le rôle de Oct-4 in Les cellules souches embryonnaires (cellules ES), vivo est l'établissement de son profil d'expression issues de la masse interne du blastocyste, se lors des premiers jours du développement caractérisent par leur capacité à s'autorenouveler embryonnaire. A cet effet, des blastocystes âgés de et à se différencier en n'importe quel type 4,5 jours (pc) ont été collectés à partir de souris cellulaire de l'organisme adulte. De nombreux gestantes et mis en culture pendant 5 jours en travaux ont tenté de définir les bases moléculaires présence de 100 ng/mL de SCF. Le taux de l'état particulier de ces cellules ES, souvent d'expression de Oct-4 est évalué par RT-qPCR qualifié de « ». Ainsi Oct-4 a été [Fig. 1]. La quantité d'ARNm codant pour Oct-4
identifié comme un facteur de transcription atteint un pic d'expression à 6,5 jours (pc) puis précoce au cours du développement embryonnaire chute très rapidement. intervenant dans la maintenance de la pluripotence cellulaire : l'inhibition de l'expression d'Oct-4 entraîne la perte de la pluripotence des cellules ES, puis leur différenciation vers le trophectoderme [Nichols et al. 1998]. Cependant, d'autres résultats tendent également à suggérer l'implication d'Oct-4 dans des phénomènes de différenciation cellulaire : la surexpression d'Oct-4, maintenue pendant plusieurs jours, entraîne la différenciation des cellules ES vers l'endoderme primitif et/ou le Fig. 1 : Oct-4 présente un pic d'expression vers le jour
6,5 (pc). Résultats d'analyse d'expression par RT-qPCR.
mésoderme [Niwa et al. 2000]. Le taux d'expression de Oct-4 est normalisé par rapport au Les présents travaux se placent dans la continuité taux d'expression de la tubuline. Le niveau relatif d'expression est calculé en prenant comme référence le taux de ces observations et tentent d'aller au-delà en d'expression dans les blastocystes nouvellement prélevés. démontrant un rôle d'Oct-4 dans la différenciation Chaque point correspond à au moins six blastocystes.
cellulaire cardiaque. Une première série d'expériences d'induction montre que l'expression Nodal induit l'expression de Oct-4 in vitro.
d'Oct-4 au cours du développement embryonnaire est régulée par le facteur Nodal, un inducteur du Nodal est le facteur de la famille des TGF-β le mésoderme. Une deuxième série d'expériences plus précocement exprimé lors du développement modulant l'expression d'Oct-4 in vitro et in vivo embryonnaire. En plus d'intervenir dans démontre un rôle spécifique d'Oct-4 dans la l'établissement des axes embryonnaires, il spécification, puis la différenciation cardiaque. participe à l'induction du mésendoderme chez les Vertébrés et en particulier du mésoderme Résultats
cardiaque [Conlon et al. 1994, Zhou et al. 1993]. Afin de déterminer si Nodal module l'expression Oct-4 présente un pic d'expression au cours des
de Oct-4, des cellules CGR8 ont été mises en premiers jours du développement embryonnaire.
culture pendant 48h en présence de LIF et de







différentes concentrations du facteur Nodal. Le On remarque une différence dans l'intensité, dans taux d'expression de Oct-4 est évalué par RT- l'étendue et dans la persistance de la fluorescence : qPCR [Fig. 2].
Oct-4 est plus fortement et plus longtemps exprimé dans les blastocystes en présence de Nodal. On remarque également que l'intensité et l'étendue de la fluorescence sont maximales au jour 3 et en présence de Nodal. On note enfin la présence de corps apoptotiques au jour 4 et en absence de Nodal : cette observation est probablement à raccorder avec la faible quantité de Oct-4 compromettant la viabilité du blastocyste. Fig. 2 : Nodal induit l'expression de Oct-4 in vitro.
Résultats d'analyse d'expression par RT-qPCR en absence La voie de signalisation canonique des facteurs de (Control) ou en présence de Nodal (10 ou 50ng/mL). On notera l'absence de linéarité entre le taux d'expression de la famille des TGF-β est la voie des Smads. La Oct-4 et la concentration de Nodal. Le taux d'expression de fixation de Nodal sur son récepteur provoque la Oct-4 est normalisé par rapport au taux d'expression de la tubuline. Le niveau relatif d'expression est calculé en prenant phosphorylation de Smad2 puis son association comme référence le taux d'expression en absence de Nodal. avec Smad4 et d'autres facteurs transcription [Kumar et al. 2001, Lee et al. 2001, Yeo & On remarque que Nodal induit une augmentation Whitman 2001], permettant ainsi la régulation de de l'expression de Oct-4. Cette augmentation en différents gènes. présence de Nodal est du même ordre de grandeur Afin de confirmer l'implication des facteurs de la que celle obtenue in vivo (cf. Fig. 1) : ×3,2 pour
famille des TGF-β dans l'activation de Oct-4 par 10ng/mL et ×4,5 pour 50ng/mL. l'intermédiaire de Smad2, une caractérisation des facteurs se liant au promoteur de Oct-4 s'avère Nodal induit l'expression de Oct-4 in vivo.
judicieuse. A cet effet, une immuno-précipitation de chromatine a été réalisée en utilisant un Afin de valider in vivo les résultats précédents, des anticorps anti-Smad4 sur des cellules mises en blastocystes âgés de 4,5 jours ont été collectés à culture en absence ou présence de TGF-β pendant partir de souris transgéniques, possédant le gène 48h. Les fragments d'ADN obtenus après codant pour la GFP sous le contrôle du promoteur immuno-précipitation ont été quantifiés par RT- d'Oct-4, puis mis en culture sur lame Labtek® en qPCR et ont ensuite été analysés par présence de Nodal. Le taux d'expression d'Oct-4 électrophorèse [Fig .4].
est évalué par l'étendue du territoire cellulaire fluorescent [Fig. 3].
Fig. 3 : Nodal induit l'expression
de Oct-4 in vivo.
Blastocystes
après éclosion en absence (Control)
ou en présence de Nodal
(50ng/mL). Clichés obtenus par
microscopie à épifluorescence.
Pour chaque condition, à G
lumière transmise, à D fluorescence. Le jour 1 correspond à l'éclosion du blastocyste, équivalent au jour 4,5 (pc). On remarquera que la différence d'intensité de la fluorescence est présente dès le jour 2 et que la fluorescence persiste plus longtemps en présence de Nodal. On notera également la présence de petites vésicules au contenu sombre dès le jour 3 en absence de Nodal.



Fig. 4 : TGF-β induit l'expression de Oct-4 par
l'intermédiaire de Smad4.
A. Courbes de
fusion pour les différents fragments amplifiés
par RT-qPCR.
A1 : promoteur proximal de Oct-4
(Oct-4 P), A2 : promoteur distal de Oct-4 (Oct-4 D),
A3 : promoteur de Nkx2.5. Le promoteur de Nkx2.5
constitue un contrôle positif. En vert : ADN
génomique. En rouge : fragments d'ADN obtenus
par ChIP à partir de cellules non traitées. En noir :
fragments d'ADN obtenus par ChIP à partir de
cellules traitées par TGF-β. B. Analyse sur gel
des différents fragments amplifiés par RT-
qPCR.
Les tailles attendues des fragments sont :
187 bp pour Oct-4 P, 148 bp pour Oct-4 D, 255 bp
pour Nkx2.5.
L'analyse quantitative montre que le nombre de L'upregulation d'Oct-4 in vitro induit la
fragments amplifiés dans les promoteurs différenciation cardiaque.
proximal et distal de Oct-4 est plus important lorsque les cellules sont traitées par TGF-β : ceci Afin de préciser le rôle de l'upregulation de Oct- montre donc que TGF-β induit effectivement 4 observable in vivo, des cellules ES issues du l'induction de Oct-4 par l'intermédiaire de clone ZHBTc6 ont été mises en culture pendant Smad4, ce dernier se fixant directement sur le 48h en l'absence de tétracycline. Le taux promoteur de Oct-4. Le contrôle positif permet d'expression de Oct-4 et de différents marqueurs de vérifier que l'immuno-précipitation s'est embryonnaires est évalué par RT-qPCR [Fig. 5].
réalisée avec la même efficacité pour les deux conditions. L'analyse qualitative sur gel permet de s'assurer de la présence des fragments attendus : pour Oct-4 P, on obtient une bande proche de 200 bp ; pour Oct-4 D, on obtient une bande entre 100 et 200 bp ; pour Nkx2.5, on obtient une bande entre 200 et 300 bp. Cette première série d'expérience a permis de conforter le rôle de Nodal dans l'induction de Oct-4, vraisemblablement par l'intermédiaire de Smad4, à la fois in vitro et in vivo et suggère fortement son implication dans le pic d'expression transitoire observable dans les Fig. 5 : L'upregulati
on de Oct-4 in vitro induit l'expression
de gènes cardiaques. Résultats d'analyse d'expression par
blastocystes âgés de 4,5 à 8,5 jours (pc). Afin de RT-qPCR. En rouge : ma rqueurs mésodermiques (points : déterminer plus précisément le rôle de ce pic mésoderme cardiaque ; barres : cœur). En Orange : marqueurs mésendodermiques. En Vert : marqueurs endodermiques. En d'expression au cours du développement s ectodermiques. Le taux d'expression des
embryonnaire, deux séries d'expériences ont été différents gènes est normalisé par rapport au taux d'expression entreprises : des expériences d' de la tubuline. Le niveau relatif d'expression est calculé en upregulation de prenant comme référence le taux d'expression en présence de Oct-4 in vitro en utilisant le clone tet-OFF tet. Les bâtons représenten t les moyennes, les barres d'erreur représentent les écarts-type. Moyennes et écarts-type ont été ZHBTc6, reconnu pour son efficacité dans calculés sur six expériences. l'induction de Oct-4 [Niwa et al. 2000] et des expériences de downregulation d'Oct-4 in vivo On remarque tout d'abord que le pourcentage par l'utilisation des ARN interférents. d'induction de Oct-4 est proche de celui obtenu par traitement par Nodal (cf Fig. 2). On différenciées, que les gènes du mésoderme remarque ensuite que les gènes significativement cardiaque, ainsi que les gènes proprement induits correspondent aux gènes du mésoderme cardiaques sont fortement induits. On remarque cardiaque (Tbx6, Mesp1) et aux gènes également que Brachyury, marqueur du proprement cardiaques (Nkx2.5, Tbx5, Mef2c, mésoderme primitif, est très fortement induit Myocardin, Actin). Les forts taux d'induction (×35) : ceci s'explique vraisemblablement par le suggèrent l'existence d'une voie de signalisation fait que le fort taux de Oct-4 a induit la directe entre Oct-4 et ces mêmes gènes. prolifération des cellules précurseurs du Parallèlement, les marqueurs des autres feuillets mésoderme. Ces données permettent donc de embryonnaires sont peu affectés par conclure que la spécification cardiaque, observée l'upregulation de Oct-4 (α-FP, TPA, Nestin). chez les cellules ES non différenciées, aboutit Ces données tendent à montrer que effectivement à la différenciation cardiaque. l'upregulation de Oct-4 induit la spécification des cellules vers le mésoderme cardiaque. La downregulation de Oct-4 in vivo aboutit à un
Afin de s'assurer que cette spécification développement embryonnaire anormal.
cardiaque aboutit effectivement à une différenciation cardiaque, ces cellules ont subi le Une autre voie d'investigation pour préciser le même traitement que précédemment puis ont été rôle du pic d'expression transitoire de Oct-4 mises en différenciation par la méthode des consiste à empêcher l'apparition de ce pic et à en gouttes en absence de tetracycline étudier les conséquences sur le développement pendant 2 jours. Les corps embryoïdes ainsi formés ont embryonnaire. La stratégie utilisée est celle des ensuite été mis en suspension en absence de ARN interférents : des blastocystes âgés de 4,5 jours (pc) ont été collectés et injectés avec un pendant 3 jours. Le taux d'expression d'Oct-4 et de différents marqueurs siRNA anti-Oct-4 associé au peptide vecteur embryonnaires est évalué par RT-qPCR [ MPG2. Ceux-ci sont ensuite réimplantés dans l'utérus de souris pseudo-gestantes. Les
embryons âgés de 12,5 jours (pc) sont extraits de
l'utérus des souris et leur morphologie est
analysée afin de détecter d'éventuelles anomalies
développementales [Fig. 7].
n de Oct-4 in vitro induit la
différenciation cardiaque. Résultats d'analyse d'expression
par RT-qPCR. En rouge
: marqueurs mésodermiques (points : mésoderme cardiaque ; barre s : cœur). En Orange : marqueurs mésendodermiques. En Bleu : marqueurs ectodermiques. Le
taux d'expression des différent

s gènes est normalisé par rapport au taux d'expr ession de la tubuline. Le niveau relatif d'expression est calculé en prenant comme référence le taux d'expression en présence de tet. Certains gènes n'ont pas été : Tal1, SRF, aFP, TPA. Les mesures n'ont pas été Dans le cas des corps embryoïdes, les taux Fig. 7 : La downregulation de Oct-4 provoque un
d'induction sont beaucoup plus importants : Oct- développement embryonn
aire anormal. A. Résultats
4 est induit 14 fois plus qu'en condition contrôle. rphologiques des embryons âgés de 12,5 jours (pc). Les résultats sont exprimés en pourcentage. Ceci est à relier au fait que les cellules ont été : n=87. Les bâtons placées en différenciation en l'absence de t les moyennes, les barres d'erreur représentent les écarts-type. B. Embryons âgés de 12,5
tetracycline, ainsi le promoteur inductible est : MPG2 seul, le développement est normal. B2 : resté activé pendant 5 jours consécutifs. On MPG2 + siRNA, léger retard de croissance. B3 : MPG2 + siRNA, retard de croissance sévère. remarque, à l'instar des cellules ES non On remarque tout d'abord que le MPG2 seul notre cas, il s'agit de Nkx2.5), une observation n'affecte pas le développement des embryons, attendue de part leur rôle cardiogénique au cours alors que la présence du siRNA entraîne une de l'embryogenèse [Akhurst et al. 1990]. On forte proportion d'embryons avortés (60 à 75%). notera également la présence de bandes vers La plupart des embryons ayant survécu jusqu'au : celles-ci semblent dépendre de la jour 12,5 (pc) accusent un retard de croissance séquence du primer ; elles résultent notable. Ces observations semblent donc vraisemblablement de la fixation non spécifique souligner l'importance de l'existence du pic des primers du fait de la faible pureté des d'expression transitoire de Oct-4. Il serait ici échantillons à la suite de l'immuno-précipitation intéressant de déterminer avec plus de précision de la chromatine. quels tissus sont affectés par l'interférence à Afin de tester plus directement le rôle d'Oct-4 dans cette spécification cardiaque des cellules ES, nous avons utilisé un clone Les expériences d'upregulation et de inductible contenant une cassette tet-OFF dans le downregulation d'Oct-4 permettent d'éclaircir promoteur d'Oct-4. Ces expériences ont quelque peu la fonction biologique du pic confirmé que l'élévation du niveau d'expression d'expression transitoire d'Oct-4 : celui-ci semble d'Oct-4, dans la cellules ES, d'une amplitude indispensable pour la spécification du similaire à celle induite par les facteurs mésoderme cardiaque, puis pour la cardiogéniques de la superfamille du TGFβ, différenciation cardiaque proprement dite. déclenche l‘expression de gènes marqueurs du L'absence ce pic s'avère peu viable pour les mésoderme et des progéniteurs cardiaques. Cet évènement se traduit par la suite par un processus de cardiogenèse accrue dans les corps embryoïdes. Les expériences d'induction Discussion
réalisées sur les corps embryoïdes révèlent des taux d'induction très élevés du fait de Nous avons révélé que le niveau l'activation du promoteur d'Oct-4 pendant 5 d'expression de Oct-4 s'élève transitoirement au jours. Il serait ainsi intéressant de reproduire ces cours de la différenciation précoce des cellules manipulations en n'activant le promoteur que de la couche interne du blastocyste avant de pendant 48h, afin de mimer le pic d'expression diminuer progressivement. Ce résultat suggère transitoire observable in vivo. Ces résultats que le facteur de transcription Oct-4 a non auraient une plus grande signification seulement un rôle de gardien de la pluripotence de ces cellules mais aussi une fonction dans leur Nous avons enfin mené des expériences différenciation précoce. Des expériences in vitro de downregulation d'Oct-4 in vivo par et in vivo, ont de plus montré que Nodal, un l'intermédiaire d'ARN interférents dirigés contre facteur inducteur du mésendoderme chez les l'ARN messager d'Oct-4. L'efficacité Vertébrés et en particulier du mésoderme d'inhibition d'expression par l'ARN interférent cardiaque [Conlon et al. 1994, Zhou et al. 1993] étant difficilement évaluable, nous avons été stimule l'expression d'Oct-4. Le fait que contraints de multiplier les échantillons afin de l'intensité et l'étendue de la fluorescence de la réaliser une étude statistique. Celle-ci révèle que GFP, dont l'expression est pilotée par le les embryons traités par le siRNA n'arrivent pas promoteur d'Oct-4, soient maximales dans les à terme ou bien présentent un retard de cellules du blastocyste en différenciation au jour croissance et des malformations. Il serait 3 en présence de Nodal peut en effet être corrélé intéressant de déterminer quels tissus sont avec l'existence du pic d'expression d'Oct-4 (le affectés par la downregulation d'Oct-4 par la jour 3 après éclosion correspondant au jour 6,5 réalisation de coupes histologiques, bien que (pc)) (cf. Fig. 1).
nous puissions spéculer que la fonction Nous avons ensuite montré que la cardiovasculaire, sans doute altérée chez ces stimulation de l'expression d'Oct-4 par les embryons, affecte le développement d'autres facteurs de la superfamille du TGF-β emprunte la voie de signalisation des Smads. On remarque, Pour conclure, notre étude a montré au cours de cette expérience, que ces mêmes qu'un même facteur peut, dans des conditions facteurs induisent des gènes cardiaques (dans particulières (niveau d'expression, cinétique d'expression.) être impliqué dans des processus différenciation (milieu précédent sans LIF), sont biologiques à priori incompatibles déposées sur le couvercle d'une boîte puis pluripotence et la différenciation cellulaire. Le renversées. Les corps embryoïdes sont cas d'Oct-4 vient ainsi alimenter le concept observables deux jours plus tard. également au cours du développement cardiaque Extraction des ARN et Transcription Inverse
avec Tbx20 [Takeuchi et al. 2005]. Ce concept développe l'idée qu'un même gène peut La totalité des ARN cellulaires des cellules ES et entraîner des effets cellulaires très contrastés en des corps embryoïdes sont extraits par fonction de son niveau d'expression. Un tel l'utilisation d'un Kit d'extraction (Zymo concept rend donc sujets à caution les résultats Research, CA, USA). La transcription inverse est d'inactivation totale de gènes, abondants au réalisée sur 1 µg d'ARN par l'utilisation de la cours de la dernière décennie, obtenus par la transcriptase inverse Mu-MLV (Invitrogen, technique du Knock-Out. Dans l'optique de tester ce concept, une approche haut-débit par l'étude de l'interactome (ChIP on Chips) et du Real Time – quantitative PCR
transcriptome (RNA Chips) dans différentes
Les réactions d'amplification sont réalisées dans
conditions d'expression d'Oct-4 se révèlerait un LightCycler® (Roche Diagnostics, riche d'informations. Switzerland) selon les recommandations du constructeur : chaque capillaire contient 10 µL de Reaction Mix (Taq polymérase, tampon de Matériel et Méthodes
réaction, désoxynucléotides triphosphate, SYBR Green I dye®) et 2 µL d'ADNc. Le programme Lignées de cellules ES
d'amplification comprend dénaturation (8min / 95°C), la phase CGR8 : la lignée cellulaire CGR8 a été établie à d'amplification de 45 cycles (3s / 95°C, 10s / partie de la masse interne d'un blastocyste de 65°C, 10s / 72°C). Après amplification, une souris âgé de 3,5 jours. La différenciation courbe de fusion pour chaque échantillon est spontanée des cellules CGR8 est inhibée par la obtenue par une augmentation lente et linéaire de présence de LIF. Leur culture ne nécessite pas de la température de 0,1°C à 95°C : cette courbe est utilisée pour évaluer la spécificité des produits de PCR, confirmée par la suite par une analyse ZHBTc6 : la lignée cellulaire ZHBTc6 a été obtenue par l'introduction d'une construction tet- OFF dans des cellules ES de souris. Les cellules Immuno-précipitation de chromatine (ChIP)
ZHBTc6 ont un allèle d'Oct-4 inactivé par l'intégration d'une cassette IRESzeopA Les cellules subissent tout d'abord une étape de contenant un transgène Oct-4 dont le promoteur cross-linking dans une solution de est régulé par la tétracycline. Ce transgène est PBS/formaldéhyde 1%. Elles sont ensuite activé en l'absence de tétracycline. Leur culture perméabilisées puis lysées dans un tampon de ne nécessité pas de « feeders ». lyse SDS 1%. Afin d'améliorer cette étape, les cellules sont soniquées 10 fois par 6 pulses de 3s Propagation, induction et différenciation des
et d'amplitude 70. Le lysat est épuré par une cellules ES
incubation de 4h à 4°C en présence de billes de protéine A – Sepharose®. Une petite quantité Les cellules ES sont propagées sur des boîtes (50 à 100 µg) de la chromatine ainsi purifiée est gélatinisées en présence de GMEM supplémenté mise en présence de l'anticorps pendant 12h à avec du pyruvate, des acides aminés non 4°C. La fraction de chromatine immuno- essentiels, du mercaptoéthanol, du sérum fétal de précipitée est récupérée après une incubation de veau et du LIF. Les expériences d'induction sont 4h à 4°C en présence de billes de protéine A – réalisées sur 48h en présence de 10 ou 50 ng/mL Sepharose® puis subit une étape de reverse de Nodal ou 2,5 ng/mL de TGF-β. Les cellules cross-linking dans une solution de NaCl 5M. ES sont mises en différenciation par la méthode L'ADN est ensuite extrait par un traitement au des gouttes : des gouttes de 25 µL, contenant phénol-chloroforme. entre 1000 et 1500 cellules/mL dans du milieu de Interférence à ARN
Yeo C, Whitman M. Nodal signals to Smads through cripto- dependent and cripto-independent mechanisms. Mol. Cell,
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Le siRNA anti-Oct-4 a été obtenu par synthèse chimique et purifié par HPLC. Après hybridation Zhou X, Sasaki H, Lowe L, Hogan BL, Kuehn MR. Nodal is des brins sens et anti-sens, le siRNA est associé a novel TGF-beta-like gene expressed in the mouse node au peptide vecteur MPG2. Les blastocystes, during gastrulation. Nature, 2000 (361:543–47)
collectés à partir de souris gestantes, sont microinjectés avec le MPG2 seul ou lié au siRNA. Les blastocystes ainsi microinjectés sont réimplantés dans des souris pseudo-gestantes. Je tiens à assurer Michel Pucéat, Franck Aimond, Claudine Ménard et Corinne Grey de Séquences des oligonucléotides utilisés
toute ma gratitude pour leurs conseils avisés et Oct-4 F : 5'-TCAGCTTGGGCTAGAGAAGG-3' leur disponibilité. Oct-4 R : 5'-TGACGGGAACAGAGGGAAAG-3' Oct-4-P F : 5'-CAGGGCATGGTGTAGGAGCAGA-3' Oct-4-P R : 5'-AAGGAGACGGGATTAGGAGGAG-3' Oct-4-D F : 5'-CCAAAAGAGAAATCACAATCCA-3' Oct-4-D R : 5'-GGCTACAACCTCCCCACACC-3' GMEM : Glasgow Minimum Essential Medium Oct-4-siRNA F : 5'-AGGUGUUCAGCCAGACCACdtdt-3' HPLC : High Pressure Liquid Chromatography Oct-4-siRNA R : 5'-GUGGUCUGGCUGAACACCUdtdt-3' LIF : Leukemia Inhibitory Factor pc : post-coitum RT-qPCR : Real Time – quantitative PCR SCF : Stem Cell Factor Références bibliographiques
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Source: http://enslyon.free.fr/rapports/biologie/Mathieu_Gineste_1.pdf

Powerpoint presentation

Doctors or Managers – Who has the solutions for workplace wellbeing? IOSH : Wellbeing – That Works! 23 September 2015 Dr Adrian Massey MRCP FFOM Doctors or Managers? Doctors or Managers? Doctors or Managers? Doctors or Managers?  The temptation to medicalize life  The dangers of medicalizing life  Why it is becoming harder to hold the line

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Chirurgie de la main 23 (2004) 167–177 L'antibioprophylaxie en chirurgie de la main : à la recherche d'un consensus Antibioprophylaxy in hand surgery: toward a professional consensus C. Dumontier a,*,b, J.-P. Lemerle c a Service de chirurgie orthopédique, hôpital Saint-Antoine, collège de médecine des hôpitaux de Paris, 184, rue du Faubourg-Saint-Antoine, 75571 Paris cedex 12, France